第2章 循证医学与临床决策 第4章 心力衰竭发生机制及其诊治研究进展

第3章 分子与细胞生物学技术在

内科学疾病研究中的应用第二次世界大战结束以后,自然科学发展的一个突出特点是各学科发展中的相互协同和相互杂交,直至今日,这种状态仍继续发展和深化,新的杂交学科或跨部门学科不断形成,对自然现象的认识越来越深入全面,分子与细胞生物学就是上述自然学科发展总趋势下产生的,它从分子及细胞水平阐明生命现象,并探讨生物体的遗传现象以及它和物理学、化学及生命科学之间的相互关系。

一、分子与细胞生物学常用实验技术

1.细胞培养

细胞培养是指从体内组织取出细胞模拟体内出现环境,在无菌、适当温度及酸碱度和一定营养条件下,使其生长繁殖,并维持其结构和功能的一种培养技术。细胞培养的培养物为单个细胞或细胞群。

细胞培养的一般过程:

(1)取材:在无菌环境下从机体取出某种组织细胞,经过一定的处理(如消化分散细胞、分离等)后接入培养器血中,这一过程称为取材。如是细胞株的扩大培养则无取材这一过程。机体取出的组织细胞的首次培养称为原代培养。理论上讲各种动物和人体内的所有组织都可以用于培养,实际上幼体组织比成年个体的组织容易培养,分化程度低的组织比分化高的容易培养,肿瘤组织比正常组织容易培养。取材后应立即处理,尽快培养,因故不能马上培养时,可将组织块切成黄豆般大的小块,置于4℃的培养液中保存。取组织时应严格保持无菌。

(2)培养:将取得的组织细胞接入培养瓶或培养板中的过程称为培养。如系组织块培养,则直接将组织块接入培养器皿底部,几个小时后组织块可贴牢在底部,再加入培养基。如系细胞培养,一般应在接入培养器皿之前进行细胞计数,按要求以一定的量接入培养器皿并直接加入培养基。细胞进入培养器皿后,立即放入培养箱中,使细胞尽早进入生长状态。正在培养中的细胞应每隔一定时间观察一次,一般原代培养进入培养后有一段潜伏期(数小时到数十天不等),在潜伏期细胞一般不分裂,但可贴壁和游走。过了潜伏期后细胞进入旺盛的分裂生长期。细胞长满瓶底后要进行传代培养,将一瓶中的细胞消化悬浮后分至两到三瓶继续培养。每传代一次称为“一代”。二倍体细胞一般只能传几十代,而转化细胞系或细胞株则可无限地传代下去。转化细胞可能具有恶性性质,也可能仅有不死性(immorta1ity)而无恶性。培养正在生长中的细胞是进行各种生物医学实验的良好材料。

(3)冻存及复苏:为了保存细胞,特别是不易获得的突变型细胞或细胞株,要将细胞冻存。冻存的温度一般用液氮的温度,将细胞收集至冻存管中加入含保护剂的培养基,以一定的冷却速度冻存,最终保存于液氮中。在极低的温度下,细胞保存的时间几乎是无限的。复苏一般采用快融方法,即从液氮中取出冻存管后,立即放入37℃水中,使之在一分钟内迅速融解。然后将细胞转入培养器皿中进行培养。冻存过程中保护剂的选用、细胞密度、降温速度及复苏时温度、融化速度等都对细胞活力有影响。

2.细胞免疫检测方法和技术

免疫检测技术是指利用免疫反应特异性的原理,建立各种检测与分析的技术。常规免疫检测技术主要是用于检测抗原或抗体的体外免疫血清学反应或免疫血清学技术。免疫血清学技术是建立在抗原抗体特异性反应基础上的检测技术。现代免疫检测技术的发展非常快,已有许多新的方法和技术出现。

(1)酶免疫分析方法

酶标记抗体技术是将抗原和抗体的特异性反应与酶的催化作用有机地结合的一种新技术,现已广泛应用于各种抗原和抗体的定性、定量测定。最初的免疫酶测定法,是使酶与抗原或抗体结合,用以检查组织中相应的抗原或抗体的存在。后来发展为将抗原或抗体吸附于固相载体,在载体上进行免疫酶染色,底物显色用肉眼或分光光度仪判定。这后一种技术就是目前应用最广的酶联免疫吸附试验,即E1ISA。

免疫酶技术就是抗原和抗体的免疫反应和酶的催化反应相结合而建立的一种新技术。酶与抗原或抗体相结合后,既不改变抗原或抗体的免疫学反应特性,也不影响酶本身的酶学活性,即在相应而合适的作用底物参与下,使基质水解而显色,或使供氢体由无色的还原型变为有色的氧化型。这种有色产物可用目测或光学显微镜和电子显微镜观察,也可用分光光度仪加以检测。显色反应显示了酶的存在,从而证明发生了相应的免疫反应。因而这是一种特异而敏感的技术,可以在细胞或亚细胞水平示踪抗原或抗体的所在部位,或在微克、甚至纳克水平上对其定量。

(2)荧光抗体技术

某些荧光物质在一定条件下,既能与抗原或抗体结合,又不影响抗原与抗体的特异性结合。用荧光抗原或荧光抗体对待检标本染色后,在荧光显微镜下观察,可看到发出荧光的抗原抗体复合物。作为蛋白质标记用的荧光物质需具备如下条件:①有与蛋白质分子形成稳定共价键的化学基团,但不形成有害产物;②荧光效率高,与蛋白质结合的需要量少;③结合物在一般条件下稳定,结合后又不影响免疫活性;④作为组织学标记,结合物的荧光必须与组织的自发荧光有良好的反衬;⑤结合程序简单,能制成直接应用的商品。满足这些要求的荧光物质有异硫氰酸荧光素(FITC)、四乙基罗丹明(RB200)和四异甲基罗丹明(TMRITC)等,其中实际上应用最广的是异硫氰酸荧光素。

(3)放射免疫技术

放射免疫技术又称放射免疫分析、同位素免疫技术或放射免疫测定法。该法为一种将放射性同位素测量的高度灵敏性、精确性和抗原抗体反应的特异性相结合的体外测定超微量(10-9~10-15g)物质的新技术。广义来说,凡是应用放射性同位素标记的抗原或抗体,通过免疫反应测定的技术,都可称为放射免疫技术。经典的放射免疫技术是标记抗原与未标抗原竞争有限量的抗体,然后通过测定标记抗原抗体复合物中放射性强度的改变,测定出未标记抗原量。此技术操作简便、迅速、准确可靠,应用范围广,可自动化或用计算机处理,但需一定设备、仪器,对抗原抗体纯度要求较严格。目前常用的放射免疫技术有放射免疫饱和分析法和放射免疫沉淀自显影法。

(4)免疫组织化学

免疫组织化学是利用抗原与抗体间的特异性结合原理和特殊的标记技术,对组织和细胞内的特定抗原或抗体进行定位、定性或定量检测的一门技术。常用方法有ABC法、Envision二步法、S-p法等。最大优点是能将形态学改变与功能和代谢结合,其定位精确度目前可达到亚微结构水平,使得该技术成为生物学和医学各个领域中日益广泛应用的研究和诊断的方法。尤其是在肿瘤病理学中已经成为常规的诊断方法。

免疫组织化学的全过程包括:①抗原的提取与纯化;③免疫动物或细胞融合,制备特异性抗体以及抗体的纯化;③将显色剂与抗体结合形成标记抗体;④标本的制备;③免疫细胞化学反应以及呈色反应;⑧观察结果。

3.分子生物学技术

(1)质粒DNA的分离、纯化和鉴定

把一个目的DNA片段通过重组DNA技术,送进受体细胞中进行繁殖和表达的工具叫载体(Vector)。细菌质粒是重组DNA技术中常用的载体。质粒(p1asmid)是一种染色体外的稳定遗传因子,大小从1~200kb不等,为双链、闭环的DNA分子,并以超螺旋状态存在于宿主细胞中。质粒主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中,它具有自主复制和转录能力,能在子代细胞中保持恒定的拷贝数,并表达所携带的遗传信息。质粒的复制和转录要依赖于宿主细胞编码的某些酶和蛋白质,如离开宿主细胞则不能存活,而宿主即使没有它们也可以正常存活。

质粒的存在使宿主具有一些额外的特性,如对抗生素的抗性等。F质粒(又称F因子或性质粒)、R质粒抗药性因子和Co1质粒(产大肠杆菌素因子)等都是常见的天然质粒。

质粒在细胞内的复制一般有两种类型:紧密控制型(Stringent contro1)和松弛控制型(Re1axed contro1)。前者只在细胞周期的一定阶段进行复制,当染色体不复制时,它也不能复制,通常每个细胞内只含有1个或几个质粒分子,如F因子。后者的质粒在整个细胞周期中随时可以复制,在每个细胞中有许多拷贝,一般在20个以上,如Co1E1质粒。在使用蛋白质合成抑制剂——氯霉素时,细胞内蛋白质合成、染色体DNA复制和细胞分裂均受到抑制,紧密型质粒复制停止,而松弛型质粒继续复制,质粒拷贝数可由原来20多个扩增至1000~3000个,此时质粒DNA占总DNA的含量可由原来的2%增加至40%~50%。利用同一复制系统的不同质粒不能在同一宿主细胞中共同存在,当两种质粒同时导入同一细胞时,它们在复制及随后分配到子细胞的过程中彼此竞争,在一些细胞中,一种质粒占优势,而在另一些细胞中另一种质粒却占上风。当细胞生长几代后,占少数的质粒将会丢失,因而在细胞后代中只有两种质粒的一种,这种现象称质粒的不相容性(Incompatibi1ity)。但利用不同复制系统的质粒则可以稳定地共存于同一宿主细胞中。

质粒通常含有编码某些酶的基因,其表型包括对抗生素的抗性,产生某些抗生素,降解复杂有机物,产生大肠杆菌素和肠毒素及某些限制性内切酶与修饰酶等。

质粒载体是在天然质粒的基础上为适应实验室操作而进行人工构建的。与天然质粒相比,质粒载体通常带有一个或一个以上的选择性标记基因(如抗生素抗性基因)和一个人工合成的含有多个限制性内切酶识别位点的多克隆位点序列,并去掉了大部分非必需序列,使分子量尽可能减少,以便于基因工程操作。大多质粒载体带有一些多用途的辅助序列,这些用途包括通过组织化学方法肉眼鉴定重组克隆、产生用于序列测定的单链DNA、体外转录外源DNA序列、鉴定片段的插入方向、外源基因的大量表达等。

(2)DNA酶切及凝胶电泳

①DNA的限制性内切酶酶切分析

限制性内切酶能特异地结合于一段被称为限制性酶识别序列的DNA序列之内或其附近的特异位点上,并切割双链DNA。它可分为三类:Ⅰ类和Ⅲ类酶在同一蛋白质分子中兼有切割和修饰(甲基化)作用且依赖于ATp的存在。Ⅰ类酶结合于识别位点并随机的切割识别位点不远处的DNA,而Ⅲ类酶在识别位点上切割DNA分子,然后从底物上解离。Ⅱ类由两种酶组成:一种为限制性内切核酸酶(限制酶),它切割某一特异的核苷酸序列;另一种为独立的甲基化酶,它修饰同一识别序列。Ⅱ类中的限制性内切酶在分子克隆中得到了广泛应用,它们是重组DNA的基础。绝大多数Ⅱ类限制酶识别长度为4至6个核苷酸的回文对称特异核苷酸序列(如EcoRⅠ识别六个核苷酸序列:5′-G↓AATTC-3′),有少数酶识别更长的序列或简并序列。Ⅱ类酶切割位点在识别序列中,有的在对称轴处切割,产生平末端的DNA片段(如SmaⅠ:5′-CCC↓GGG-3′);有的切割位点在对称轴一侧,产生带有单链突出末端的DNA片段称黏性末端,如EcoRⅠ切割识别序列后产生两个互补的黏性末端。

5′…G↓AATTC…3′→5′…GAATTC…3′

3′…CTTAA↑G…5′→3′…CTTAAG…5′

DNA纯度、缓冲液、温度条件及限制性内切酶本身都会影响限制性内切酶的活性。大部分限制性内切酶不受RNA或单链DNA的影响。当微量的污染物进入限制性内切酶贮存液中时,会影响其进一步使用,因此在吸取限制性内切酶时,每次都要用新的吸管头。如果采用两种限制性内切酶,必须要注意分别提供各自的最适盐浓度。若两者可用同一缓冲液,则可同时水解。若需要不同的盐浓度,则低盐浓度的限制性内切酶必须首先使用,随后调节盐浓度,再用高盐浓度的限制性内切酶水解。也可在第一个酶切反应完成后,用等体积酚/氯仿抽提,加0.1倍体积3mo1/1NaAc和2倍体积无水乙醇,混匀后置-70℃低温冰箱30分钟,离心、干燥并重新溶于缓冲液后进行第二个酶切反应。

DNA限制性内切酶酶切图谱又称DNA的物理图谱,它由一系列位置确定的多种限制性内切酶酶切位点组成,以直线或环状图式表示。在DNA序列分析、基因组的功能图谱绘制、DNA的无性繁殖、基因文库的构建等工作中,建立限制性内切酶图谱都是不可缺少的环节,近年来发展起来的RF1p(限制性片段长度多态性)技术更是建立在它的基础上。

②凝胶电泳

琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳是分离鉴定和纯化DNA片段的标准方法。该技术操作简便快速,可以分辨用其他方法(如密度梯度离心法)所无法分离的DNA片段。当用低浓度的荧光嵌入染料溴化乙啶(ethidium bromide)染色,在紫外光下至少可以检出1~10ng的DNA条带,从而可以确定DNA片段在凝胶中的位置。此外,还可以从电泳后的凝胶中回收特定的DNA条带,用于以后的克隆操作。

(3)大肠杆菌感受态细胞的制备和转化

在自然条件下,很多质粒都可通过细菌接合作用转移到新的宿主内,但在人工构建的质粒载体中,一般缺乏此种转移所必需的mob基因,因此不能自行完成从一个细胞到另一个细胞的接合转移。如需将质粒载体转移进受体细菌,需诱导受体细菌产生一种短暂的感受态以摄取外源DNA。

转化(transformation)是将外源DNA分子引入受体细胞,使之获得新的遗传性状的一种手段,它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术。转化过程所用的受体细胞一般是限制修饰系统缺陷的变异株,即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变体(Rˉ,Mˉ),它可以容忍外源DNA分子进入体内并稳定地遗传给后代。受体细胞经过一些特殊方法(如电击法,CaC12,RbC1(KC1)等化学试剂法)的处理后,细胞膜的通透性发生了暂时性的改变,成为能允许外源DNA分子进入的感受态细胞(compenent ce11s)。进入受体细胞的DNA分子通过复制,表达实现遗传信息的转移,使受体细胞出现新的遗传性状。将经过转化后的细胞在筛选培养基中培养,即可筛选出转化子(transformant),即带有异源DNA分子的受体细胞。

(4)RNA的提取和cDNA合成

从真核生物的组织或细胞中提取mRNA,通过酶促反应逆转录合成cDNA的第一链和第二链,将双链cDNA和载体连接,然后转化扩增,即可获得cDNA文库,构建的cDNA文库可用于真核生物基因的结构、表达和调控的分析;比较cDNA和相应基因组DNA序列差异可确定内含子存在和了解转录后加工等一系列问题。总之cDNA的合成和克隆已成为当今真核分子生物学的基本手段。自20世纪70年代中叶首例cDNA克隆问世以来,已发展了许多种提高cDNA合成效率的方法,并大大改进了载体系统,目前cDNA合成试剂已商品化。cDNA合成及克隆的基本步骤包括用反转录酶合成cDNA第一链,聚合酶合成cDNA第二链,加入合成接头以及将双链DNA克隆到适当载体(噬菌体或质粒)。

(5)重组质粒的连接、转化及筛选

质粒具有稳定可靠和操作简便的优点。如果要克隆较小的DNA片段(<10kb)且结构简单,质粒要比其他任何载体都要好。在质粒载体上进行克隆,从原理上说是很简单的,先用限制性内切酶切割质粒DNA和目的DNA片段,然后体外使两者相连接,再用所得到重组质粒转化细菌,即可完成。

(6)基因组DNA的提取

基因组DNA的提取通常用于构建基因组文库、Southern杂交(包括RF1p)及pCR分离基因等。利用基因组DNA较长的特性,可以将其与细胞器或质粒等小分子DNA分离。加入一定量的异丙醇或乙醇,基因组的大分子DNA即沉淀形成纤维状絮团飘浮其中可用玻棒将其取出,而小分子DNA则只形成颗粒状沉淀附于壁上及底部,从而达到提取的目的。一般来说,构建基因组文库,初始DNA长度必须在100kb以上,否则酶切后两边都带合适末端的有效片段很少。而进行RF1p和pCR分析,DNA长度可短至50kb,在该长度以上,可保证酶切后产生RF1p片段(20kb以下),并可保证包含pCR所扩增的片段(一般2kb以下)。

不同生物(植物、动物、微生物)的基因组DNA的提取方法有所不同;不同种类或同一种类的不同组织因其细胞结构及所含的成分不同,分离方法也有差异。

(7)RF1p和RApD技术

DNA分子水平上的多态性检测技术是进行基因组研究的基础。RF1p(Restriction Fragment 1ength po1ymorphism,限制片段长度多态性)已被广泛用于基因组遗传图谱构建、基因定位以及生物进化和分类的研究。RF1p是根据不同品种(个体)基因组的限制性内切酶的酶切位点碱基发生突变,或酶切位点之间发生了碱基的插入、缺失,导致酶切片段大小发生了变化,这种变化可以通过特定探针杂交进行检测,从而可比较不同品种(个体)的DNA水平的差异(即多态性),多个探针的比较可以确立生物的进化和分类关系。所用的探针为来源于同种或不同种基因组DNA的克隆,位于染色体的不同位点,从而可以作为一种分子标记(Mark),构建分子图谱。当某个性状(基因)与某个(些)分子标记协同分离时,表明这个性状(基因)与分子标记连锁。分子标记与性状之间交换值的大小,即表示目标基因与分子标记之间的距离,从而可将基因定位于分子图谱上。分子标记克隆在质粒上,可以繁殖及保存。不同限制性内切酶切割基因组DNA后,所切的片段类型不一样,因此,限制性内切酶与分子标记组成不同组合进行研究。常用的限制性内切酶是hindⅢ,BamhⅠ,EcoRⅠ,EcoRV,XbaⅠ,而分子标记则有几个甚至上千个。分子标记越多,则所构建的图谱就越饱和。构建饱和图谱是RF1p研究的主要目标之一。

RApD(Random amp1ified po1ymorphic DNA,随机扩增的多态性DNA)即运用随机引物扩增寻找多态性DNA片段。尽管RApD技术诞生的时间很短,但由于其独特的检测DNA多态性的方式以及快速、简便的特点,使这个技术已渗透于基因组研究的各个方面。该RApD技术建立于pCR技术基础上,它是利用一系列(通常数百个)不同的随机排列碱基顺序的寡聚核苷酸单链(通常为10聚体)为引物,对所研究基因组DNA进行pCR扩增,聚丙烯酰胺或琼脂糖电泳分离,经EB染色或放射性自显影来检测扩增产物DNA片段的多态性,这些扩增产物DNA片段的多态性反映了基因组相应区域的DNA多态性。RApD所用的一系列引物DNA序列各不相同,但对于任一特异的引物,它同基因组DNA序列有其特异的结合位点,这些特异的结合位点在基因组某些区域内的分布如符合pCR扩增反应的条件,即引物在模板的两条链上有互补位置,且引物3′端相距在一定的长度范围之内,就可扩增出DNA片段。因此如果基因组在这些区域发生DNA片段插入、缺失或碱基突变,就可能导致这些特定结合位点分布发生相应的变化,而使pCR产物增加、缺少或发生分子量的改变。通过对pCR产物检测即可检出基因组DNA的多态性。分析时可用的引物数很大,虽然对每一个引物而言其检测基因组DNA多态性的区域是有限的,但是利用一系列引物则可以使检测区域几乎覆盖整个基因组。因此RApD可以对整个基因组DNA进行多态性检测。另外,RApD片段克隆后可作为RF1p的分子标记进行作图分析。

(8)聚合酶链式反应(pCR)扩增和扩增产物克隆

聚合酶链反应(po1ymerase Chain Reaction,pCR)是一种选择性体外扩增DNA或RNA的方法。它包括三个基本步骤:①变性(Denature):目的双链DNA片段在94℃下解链;②退火(Annea1):两种寡核苷酸引物在适当温度(50℃左右)下与模板上的目的序列通过氢键配对;③延伸(Extension):在Taq DNA聚合酶合成DNA的最适温度下,以目的DNA为模板进行合成。由这三个基本步骤组成一轮循环,理论上每一轮循环将使目的DNA扩增一倍,这些经合成产生的DNA又可作为下一轮循环的模板,所以经25~35轮循环就可使DNA扩增达106倍。

4.分子杂交技术

互补的核苷酸序列通过Wa1son-Crick碱基配对形成稳定的杂合双链分子DNA分子的过程称为杂交。杂交过程是高度特异性的,可以根据所使用的探针已知序列进行特异性的靶序列检测。

杂交的双方是所使用探针和要检测的核酸。该检测对象可以是克隆化的基因组DNA,也可以是细胞总DNA或总RNA。根据使用的方法被检测的核酸可以是提纯的,也可以在细胞内杂交,即细胞原位杂交。探针必须经过标记,以便示踪和检测。使用最普遍的探针标记物是同位素,但由于同位素的安全性,近年来发展了许多非同位素标记探针的方法。

核酸分子杂交具有很高的灵敏度和高度的特异性,因而该技术在分子生物学领域中已广泛地使用于克隆基因的筛选、酶切图谱的制作、基因组中特定基因序列的定性、定量检测和疾病的诊断等方面。因而它不仅在分子生物学领域中具有广泛地应用,而且在临床诊断上的应用也日趋增多分子杂交是通过各种方法将核酸分子固定在固相支持物上,然后用放射性标记的探针与被固定的分子杂交,经显影后显示出目的DNA或RNA分子所处的位置。

根据被测定的对象,分子杂交基本可分为以下几大类:①Southern杂交:DNA片段经电泳分离后,从凝胶中转移到硝酸纤维素滤膜或尼龙膜上,然后与探针杂交。被检对象为DNA,探针为DNA或RNA。②Northern杂交:RNA片段经电泳后,从凝胶中转移到硝酸纤维素滤膜上,然后用探针杂交。被检对象为RNA,探针为DNA或RNA。③其他:包括斑点(dot)杂交、狭槽(s1ot)杂交和菌落原位杂交等。

5.测序技术

在分子生物学研究中,DNA的序列分析是进一步研究和改造目的基因的基础。目前用于测序的技术主要有Sanger等(1977)发明的双脱氧链末端终止法和Maxam和Gi1bert(1977)发明的化学降解法。这两种方法在原理上差异很大,但都是根据核苷酸在某一固定的点开始,随机在某一个特定的碱基处终止,产生A、T、C、G四组不同长度的一系列核苷酸,然后在尿素变性的pAGE胶上电泳进行检测,从而获得DNA序列。目前Sanger测序法得到了广泛的应用。

二、分子与细胞生物学在内科疾病中的应用

由于分子与细胞生物学的发展以及医学科学的深入研究,二者势必相互结合。并逐步形成了分子生理学、分子病理学、分子病毒学、分子免疫学、分子病理学、分子毒理学、分子免疫学、分子药理学、分子病毒学、分子寄生虫学等等。以上各学科的研究成果为进行病因学及发病学研究提供重要依据,并在各类疾病中展开。其中在遗传病代谢的研究上有更多进展,主要包括:糖代谢、氨基酸代谢、脂蛋白、脂质代谢、类固醇代谢、酶代谢、血色素代谢和珠蛋白代谢等。肿瘤分子生物学目前已受到了世界各国学者的重视,特别是对病因和癌变机制进行了大量工作。

基因组测序是基因芯片最早的用途之一。芯片技术中的杂交测序技术及邻堆杂交技术可用于含重复序列及较长序列的DNA序列测定及不同基因组同源区域的序列比较,这也是基因芯片技术早期的主要方法。运用基因芯片寻找新基因,用于基因发现。

1.运用分子与细胞生物学理论和方法进行疾病诊断

从病人的基因组中分离出DNA与DNA芯片杂交就可以得出病变图谱。通过比较、分析这两种图谱可以得出病变的DNA信息。例如,Affymetrix公司把p53基因全长序列和已知突变的探针集成在芯片上,制成p53基因芯片,将在癌症早期诊断中发挥作用;又如,he11er等构建了96个基因的cDNA微阵列,用于检测分析风湿性关节炎(RA)相关的基因,以探讨DNA芯片在感染性疾病诊断方面的应用。现在,肝炎病毒检测诊断芯片、结核杆菌耐药性检测芯片、多种恶性肿瘤相关病毒基因芯片等一系列诊断芯片逐步开始进入市场。

基因芯片诊断技术以其快速、高效、敏感、经济、平行化、自动化等特点,成为一项现代化诊断新技术。肿瘤的发生和发展是一个复杂的多阶段过程,在多种肿瘤相关基因表达失常或许多肿瘤抑制基因失活的情况下发生。而正常基因的突变或缺失、癌基因的异常扩增和表达以及多个基因的协同作用、基因本身的多效性和机体免疫等多种因素都决定了最终肿瘤表型的表达与否。在这种情况下,基因芯片被广泛应用于多种肿瘤病例的研究。在高通量作用下,利用基因芯片表达谱数据可随时获取肿瘤细胞生长各期与肿瘤生长相关基因的表达模式。而将在肿瘤生长的各个环节和阶段中共同表达的众多基因作为一个基因簇来进行研究,可以更好地筛选出在肿瘤相关的多个环节上起作用的分子和那些可能起关键性调控作用的基因。基因芯片在肿瘤诊疗中发挥的另外一方面作用是在肿瘤分型。以前肿瘤的分类主要依靠光镜下的表现,而基因芯片的使用使基于广泛的基因表达分析的肿瘤分类方法成为可能。这种判断类型的技术能够用于辨别所有肿瘤的主要亚型,具有真实和可重复的优点。而且这种分子病理分型方法能够用于研究一些病情类似而类型不同肿瘤的基本分类机理,使诊断更为准确。此外,随着一些新的数据分析方法不断被开发基因芯片的分型和诊断也在逐步应用于其他疾病的诊断和治疗。如肝炎病毒检测诊断芯片、结核杆菌耐药性检测芯片等一系列疾病的诊断芯片被开发并逐步投入市场,为疾病的诊断和治疗提供了新的手段。

2.运用分子与细胞生物学理论和方法进行疾病治疗

(1)基因疗法

日本每年大约有40个婴儿生下来就缺乏腺苷脱氨酶,患有这种遗传病的婴儿一般活不过两周岁。虽然通过骨髓移植可以治疗,但在多数情况下找不到骨髓的提供者。日本北海道大学的研究人员与美国国立卫生研究院合作,研究出一种在“细胞内制造酶的遗传基因疗法”,将其注入遗传基因的细胞,由血液中的淋巴球变为从骨髓中分裂出来增生的血液干细胞,有效持续时间从3个月延长到半年,基因疗法的临床实验显示,约有半数以上患此病的婴儿不久将会获救。

另一项引起人们特别关注的临床实验是,将遗传基因注入癌细胞中,它是利用免疫反应及药物作用对癌症进行综合治理的方法。其效果已经在名古屋大学进行的动物实验中得到验证,并已经应用于脑肿瘤和卵巢肿瘤的治疗。用基因疗法治疗风湿性关节炎是在20世纪90年代获得美国全国卫生保健研究院基因顾问委员会批准的。神经疾病方面的研究,也是基因芯片的一个主要应用领域。这些神经系统疾病包括神经免疫性疾病、癫痫、肌萎缩、帕金森等,基因芯片对阐明其细胞发病机制、鉴别疾病的分子亚型、对疾病进行分子诊断与治疗、开发新药等都起了很大作用。

(2)干细胞工程

干细胞(stem ce11s)是一类未分化的细胞或原始细胞,是具有自我复制能力的多潜能细胞。在一定的条件下,干细胞可以分化成机体内的多功能细胞,形成任何类型的组织和器官,以实现机体内部建构和自我康复能力。由于干细胞具有特定的分化潜能,表现其全能性、多能性和专能性,近几年来世界各国科学家对干细胞的临床应用研究已取得很大的进展。

①胚胎干细胞(embryonic stem ce11s,ESCs)

ESCs是一种全能干细胞,几乎可以向所有的成年组织细胞分化。已证实胚胎干细胞可形成组成生物个体的所有组织细胞。制备出具有多巴胺产生能力的神经细胞用于帕金森病的治疗,制备出心肌细胞以修复损伤的心肌,以及制备出胰岛素产生细胞治疗糖尿病等。

②脐带血干细胞

脐带血中干细胞含量丰富,明显超过成人外周血含量,相当或超过成人骨髓。研究表明由引产的胎儿获得的脐血分离出间充质干细胞移入条件培养液中培养,20天时心肌特有的抗肌球蛋白重链抗体呈阳性。

③骨髓干细胞(bone marrow ce11s,BMCs)

骨髓干细胞有3个干细胞群,造血干细胞(hematopoietic stem ce11s,hSC)、间充质干细胞(mes-enchyma1stem ce11s,MSCs)及内皮干细胞。hSC移植后可以重建长期造血免疫功能,目前已广泛用于白血病、再生障碍性贫血、肿瘤及艾滋病等治疗。MSCs对造血干细胞不仅有空间位置的机械支持作用,还分泌许多细胞因子及生长因子支持hSC,有助于hSC未分化状态的维持,因此体外培养hSC时,用MSCs作为饲养层可促进hSC的增殖,以获大量的hSC。大剂量化疗血液病或肿瘤病人后需要进行骨髓移植重建造血功能时,同时输入MSCs会提高疗效。

在组织损伤修复中也具有很大的应用价值MSCs可以分化出多种组织类型:分化为软骨、骨组织,用于创伤缺损的修复;分化为神经,用于中枢及周围神经损伤的修复或构建人工神经等;分化为心肌组织,用于替代缺血心肌或构建人工心脏;分化为真皮组织,用于烧伤的修复;分化为肌腱组织用于肌腱断裂缺损的修复或构建人工肌腱。但影响其分化的因素很多,如基础培养基、细胞因子和生长因子、细胞密度、机械力、空间构成、生物材料、外源基因及体内所处微环境等都会影响MSCs走向不同的分化途径。而且体内和体外是截然不同的环境,MSCs在体内的分化很大程度上受到所处微环境的影响,体外很难完全模拟体内的微环境,所以MSCs在体内和体外的分化有很大的差异,因此实现对MSCs的定向诱导分化,用于组织的修复,还需要不断地探索。

在受损的组织中,新的毛细血管的形成是常见现象,内皮干细胞能形成成熟的内皮细胞和血管,对组织的修复具有重要作用。

④心肌干细胞

在动物研究中发现心肌细胞中也存在心肌祖细胞,这些细胞即具有旁细胞组织的特征,也可以表达干细胞的标志物,如ckit和sca1,为心肌损伤心肌修复提供了来源。并且,这种有益的作用是独立于细胞融合机制的。为改善损伤心肌的心脏功能开拓了广阔的前景。

⑤脂肪组织源性干细胞(adipose tissue-derived stem ce11s,ADSCs)

继骨髓干细胞之后,脂肪组织干细胞成为当今干细胞研究的又一热点。Gaustad等用大鼠心肌细胞提取液诱导人类ADSCs向心肌细胞分化,ADSCs出现双核、横纹和肌小节,表达结蛋白、肌钙蛋白Ⅰ、缝隙连接蛋白connexin43,观察到自发性搏动细胞;诱导后细胞表达核1amin A/C(终末分化细胞标记),细胞周期明显延长。表明脂肪组织中的基质细胞有干细胞的特性,并分泌能刺激缺血组织血管新生的生长因子。

⑥皮肤干细胞

我国研究人员已发现人体烧伤皮肤原位处存在着皮肤干细胞,利用它在一定药剂调控下能使烧伤皮肤原位再生,修复如初,这是我国在皮肤干细胞研究及其临床应用上的重大突破。

⑦神经干细胞(neura1stem ce11s,NSC)

NSC治疗帕金森病。NSC在神经发育和修复受损神经组织中发挥重要作用。NSC移植是修复和代替受损脑组织的有效方法,能重建部分环路和功能。利用NSC作为基因治疗载体,弥补了病毒载体的一些不足。将NSC移植到帕金森病模型的大鼠脑,NSC在其脑组织中迁移并修复损毁的脑组织,且震颤症状明显减轻。

NSC治疗多发性硬化。多发性硬化是发病率较高的神经系统疾病,在其啮齿类动物模型中发现产生髓鞘的少突胶质细胞被破坏或失去功能,将NS直接移植到大鼠脑中,移植的细胞在脑中发生了大范围的迁移,在分化成的少突胶质细胞中,约40%的细胞形成了髓鞘,其特性非常接近正常状态,一些接受移植的动物其典型的症状也得到了明显的改善。

NSC治疗脑瘤。脑胶质瘤是医学治疗的难点之一,手术切除肿瘤困难,且容易复发,放疗和化疗对肿瘤有一定的作用。由于NSC具有迁移的功能,利用这种特性可以向脑部释放药物。对大鼠NSC进行转基因处理,使之分泌白细胞介素-4(I1-4),这种物质能够激活免疫系统,对肿瘤细胞发生抗瘤攻击,患有脑胶质瘤的实验大鼠接受这种细胞注射之后,寿命比未治疗的实验大鼠大大延长。核磁共振成像表明,实验大鼠脑部的大块肿瘤有缩小的迹象,有趣的是,即使注射的NSC不分泌I1-4,实验大鼠的寿命也会延长。

NSC治疗脑缺血。激活自身NSC,并诱导其向缺血区迁移分化;异体NSC脑内移植;较为可行的策略是将转染神经营养因子的NSC移植于缺血边缘区早期利用其分化的基因产物,阻止宿主细胞的坏死和凋亡,晚期要利用其迁移、分化特性来达到结构和功能修复的目的。

NSC治疗脊髓损伤。将NSC移植入大鼠脱髓鞘的脊髓中,发现这些细胞形成髓鞘,并且这些形成髓鞘的轴突能以近似正常的速度传导冲动,这表明有功能性的髓鞘形成。基因修饰的NSC在移植后不仅可代替因损伤而死亡的神经元,而且还可以分泌神经营养因子促进神经元的存活以及轴突的再生。因此在脊髓损伤的修复中,NSC具有广阔的前景。

⑧肝干细胞

肝干细胞(hepatic stem ce11s,hSC)来源于前肠内胚层,在胚胎发育过程中以成肝细胞的形式存在,在成年哺乳动物的肝中,以小卵圆细胞的形式存在,因此又称为肝卵圆细胞。从大鼠肝脏分离的卵圆细胞移植到大鼠肝脏中,发现移植的卵圆细胞在肝内分化为肝细胞并稳定分泌白蛋白。将卵圆细胞的悬液注到正常大鼠脾脏,脾内肝细胞迅速生长。对于肝脏遗传性疾病,如肝豆状核变性(Wi1sons病),分离出患者自体卵圆细胞,进行体外扩增,利用转基因技术将缺陷基因导入卵圆细胞,筛选出转基因阳性的卵圆细胞移植入肝脏纠正代谢机能障碍。对于非遗传性疾病的基因治疗,获取自体卵圆细胞,体外扩增,导入治疗基因,如I1-10治疗自身免疫性肝疾病等。在乙型肝炎生物治疗中,肝干细胞工程也将成为一个新兴的肝细胞移植研究领域。

⑨角膜缘干细胞

角膜缘干细胞(cornea1stem ce11s,CSC)位于角膜缘上皮层基底部,但此处基底细胞只有少量干细胞,其余大部分是短暂扩充细胞。用角膜缘干细胞移植术治疗严重眼角膜疾病,已取得较好疗效。

⑩胰岛干细胞Ⅰ型糖尿病的治疗

多年来人们一直在尝试用活体胰岛移植来替代单纯注射胰岛素,有关胰岛移植的临床实践国内外多有报道,但效果并不理想,而近年来胰岛干细胞研究取得的初步进展,并给1型糖尿病的治疗带来了新希望,从长期培养的胰腺导管上皮细胞中分化出有功能的胰岛组织,胰岛干细胞经体外诱导后形成的胰岛,含有α、β和γ三种胰岛细胞,表达胰岛细胞相关的分子标志,能够对葡萄糖水平作出反应,在糖尿病NOD小鼠体内移植后矫正其血糖水平,使动物摆脱对胰岛素的依赖。胰岛干细胞的研究和开发对于1型糖尿病的治疗将具有巨大的临床应用价值。

干细胞是目前细胞工程研究最活跃的领域,随着基础研究、应用研究的进一步深化,这项技术将会在相当大程度上引发医学领域的重大变革,它已成为21世纪生命科学领域的一个热点。

(3)化学疗法

化学疗法在临床上已广泛应用,得到了明显效果,主要有抗感染和抗肿瘤两大类,其药物作用是对细胞合成代谢过程拮抗阻滞,这类药物共有六组:①拮抗阻滞叶酸合成代谢:如磺胺类制剂和pAS;②核酸合成阻滞剂:包括阻滞核苷酸中间代谢药物和影响DNA复制药物,如丝裂素等;③抑制RNA合成药物:如利福平等;④抑制蛋白合成的抗生素:如氯霉素、红霉素、四环素、链霉素等;⑤阻滞细胞壁合成的抗生素:如青霉素等;⑥作用于细胞膜的抗生素。

3.运用分子与细胞生物学理论和方法进行新药开发

应用基因重组方法人工合成一些生物体内分泌的微量活性物质,进行大规模生产,并应用于临床。如:生长激素、胰岛素、红细胞生成素、白细胞介素、GM-GSF、tpA等。

基因芯片在药物研发方面,正在逐步成为一个新的重要开发手段。在传统的药物筛选方法中,需要从其对应的生化途径起,一步步的在其代谢途径中寻找相关的蛋白或其他物质,之后再去用药物试验。不仅效率难以保证,由于人体内的途径相当复杂,这种方法的局限性也非常大。基因芯片的应用则很好地解决了这个问题,高通量的数据让研究者可以从一个比较全面的角度对药物及疾病的多种参数进行研究,从而对疾病产生的机制和药物相关靶点进行确定。同时,基因芯片是一种可以有效研究药物作用机制的工具。它可以通过检测药物作用对生物体内基因表达水平的影响,在整个生物体系的层次上,研究药物对基因调控和表达网络的影响,从而获得药物的分子机制和药物对不同生物途径的作用,以更好控制药物使用。例如,目前有研究者提出用基因芯片技术检验那些用来治疗癌症的分子靶标药物。同时,在对生物体内基因表达变化的研究过程中,一些药物在作用过程中产生的毒理作用也可以更好地被检测出来。